Обратная зависимость между амилазой крови и уровнем инсулина у свиней во время развития, бариатрической хирургии и внутривенной инфузии амилазы

Аннотация Целью данного исследования является изучение связи между уровнем амилазы в плазме и уровнем...
материалы и методы
Результаты
обсуждение

Аннотация
Целью данного исследования является изучение связи между уровнем амилазы в плазме и уровнем инсулина у растущих свиней. Кровь брали у поросят в возрасте от недоношенных (8 дней до полного периода беременности), до 90-го дня после рождения (2 месяца после отъема), которые перенесли либо операцию по удалению двенадцатиперстной кишки и тощей кишки, либо ложную операцию. Активность плазменной амилазы у недоношенных и доношенных новорожденных колебалась в пределах 500–600 ед / л и снижалась на 50% через два месяца после отъема. Уровни препрандиального инсулина и С-пептида у новорожденных поросят не были обнаружены, однако они постепенно повышались после отъема. Увеличение активности амилазы в плазме наблюдалось у молодых свиней, перенесших дуоденально-тощунную (метаболическую) операцию. Увеличение активности амилазы поджелудочной железы в крови после внутривенной инфузии амилазы снижало последующее стимулированное глюкозой высвобождение инсулина / С-пептида. Мы предполагаем роль амилазы крови в регуляции гомеостаза глюкозы после наблюдения высоких уровней амилазы в крови у новорожденных свиней, у свиней, перенесших метаболические операции, и в результате снижения стимулируемой глюкозой реакции инсулина после внутривенного введения амилазы. Уровень амилазы в крови является динамическим физиологическим параметром, который является не просто следствием выработки экзокринных пищеварительных ферментов поджелудочной железы, но скорее регулируемым фактором, участвующим в усвоении глюкозы и регуляции прандиального инсулина.
Образец цитирования: Pierzynowska KG, Lozinska L, Woliński J, Pierzynowski S (2018) Обратная зависимость между уровнями амилазы в крови и уровнями инсулина у свиней во время развития, бариатрической хирургии и внутривенной инфузии амилазы. PLOS ONE 13 (6): e0198672. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0198672
Редактор: Клеменс Фюрнсинн, Венский медицинский университет, АВСТРИЯ
Получено: 10 января 2018 г .; Принят: 23 мая 2018 года; Опубликовано 6 июня 2018 г.
Авторское право: © 2018 Pierzynowska et al. Это статья открытого доступа, распространяемая на условиях Лицензия Creative Commons Attribution , которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что авторы и источник были зачислены.
Доступность данных: наборы данных, сгенерированные и проанализированные в ходе текущего исследования, доступны в базе данных Figshare https://figshare.com/s/2507c43abc95d4b82791 ,
Финансирование: авторы не получили конкретного финансирования для этой работы.
Конкурирующие интересы: мы ознакомились с политикой журнала, и авторы этой рукописи имеют следующие конкурирующие интересы: владелец Stefan Pierzynowski, а Людмила Лозинская работает в PROF, Польша. Стефан Pierzynowski является владельцем, а Катерина Pierzynowska работает в Anara AB, Швеция. Это не меняет нашу приверженность политике PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Вступление

Примерно 100 лет назад исследователи обнаружили присутствие в крови панкреатических ферментов, таких как амилаза [ 1 - 3 ]. Было обнаружено, что уровни сывороточной амилазы (диастазы) связаны с различными физиологическими изменениями, такими как нарушение функции печени, а не просто с маркером экзокринной функции поджелудочной железы [ 2 , 4 ]. Было обнаружено, что активность сывороточной амилазы у людей сильно варьирует на ранней стадии неонатального периода у людей, обычно близко или ниже нижних пределов нормы, установленных для взрослых [ 5 ]. В последнее время более высокие уровни амилазы в крови положительно коррелировали с более высокой чувствительностью к инсулину, в то время как более низкие плазменные активности амилазы наблюдались у пациентов с ожирением и метаболическими нарушениями [ 6 - 9 ]. Все это указывает на потенциальное влияние амилазы крови на функциональность эндокринных гормонов поджелудочной железы.

Тем не менее, открытие явления гало в течение многих лет добавило поддержку надзорной функции гормонов поджелудочной железы над активностью клеток ацинусов и продукцией ферментов [ 10 ]. Теоретическое разделение между экзокринной и эндокринной поджелудочной железой было принято как недисциплинированная догма, и в результате исследования значения и физиологического значения циркуляции амилазы в крови резко сократились.

Предыдущие противоречивые данные, касающиеся источника уровней амилазы в крови, добавили путаницу в последующие исследования, которые до сих пор остаются нерешенными. В начале 1930-х годов удаление поджелудочной железы и слюнных желез на модели крысы не вызывало значительного снижения амилазы крови [ 11 ]. Вместе с гипотезой о том, что печень также может участвовать в поддержании уровня амилазы в крови, в 1958 году Дрейлинг предположил, что механизм, который регулирует уровень амилазы в крови, может быть даже внепанкреатическим [ 2 , 12 ].

В современной медицинской практике значительное увеличение уровней амилазы в сыворотке (вместе с липазой) используется в качестве маркера повреждения экзокринной поджелудочной железы ( острый панкреатит, рак поджелудочной железы). Однако использование повышенных уровней амилазы в крови в качестве маркера хронического панкреатита считалось недостаточно конкретным [ 13 - 15 ]. У многих пациентов без гастроэнтерологических симптомов могут наблюдаться изменения уровня амилазы в крови. Тем не менее, даже несмотря на то, что экзокринная поджелудочная железа является одним из основных источников активности амилазы в плазме, а уровень амилазы в поджелудочной железе в сыворотке предоставляет некоторую информацию о выработке амилазы поджелудочной железы, утверждение о том, что амилаза крови поджелудочной железы является следствием «утечки» амилазы поджелудочной железы в кровь требует большего расследования. Регулируется ли эта «утечка» амилазы поджелудочной железы в кровь? Мы полагаем, что физиологическая причина наличия циркулирующей амилазы в крови заслуживает дополнительного внимания, независимо от ее источника, прежде всего из-за потенциального участия амилазы в регуляции углеводного обмена [ 2 , 12 , 16 ].

Связь между экзокринной и эндокринной функциями поджелудочной железы очевидна при панкреатогенном диабете и нарушениях обмена веществ. В настоящее время наиболее известными методами лечения диабета являются метаболические операции, включающие исключение двенадцатиперстной кишки [ 17 ], которые могут потенциально влиять на экзокринную функцию поджелудочной железы. Наши недавние результаты показывают, что в обойденной кишке пространственное разделение панкреатических ферментов от их субстратов (пищи) уменьшает участие альфа-амилазы в пищеварительном процессе и выявляет экстра-пищеварительную активность амилазы, которая коррелирует с улучшенной толерантностью к глюкозе прандиальной крови [ 16 , 18 , 19 ]. Было обнаружено, что энтеральное введение амилазы непосредственно влияет на утилизацию глюкозы у свиней [ 18 ]. Свинья является общепринятой моделью для исследования желудочно-кишечной функции у человека [ 20 , 21 ]. Из-за сходства в морфологии и физиологии желудочно-кишечной системы, ферментативных и гормональных факторов, времени прохождения пищи и эффективности пищеварения, свиньи, которые подвергаются бариатрической хирургии, могут служить подходящими моделями [ 20 , 21 ] для изучения взаимосвязи между уровнями амилазы в плазме и использованием глюкозы. Учитывая все вышеизложенное, настоящее исследование было разработано, чтобы выяснить и подчеркнуть связь между уровнем амилазы в крови и уровнями инсулина. Таким образом, подчеркивая роль амилазы крови в регуляции внутрипанкреатической инсулиновой реакции после приема пищи, используя модель свиньи.

материалы и методы

Представленные данные были получены от: i) 18 недоношенных поросят, доставленных через кесарево сечение; ii) 4 доношенных поросенка; iii) 3 свиньи после операции на двенадцатиперстной кишке и тощей кишке (DJB) и 3 ложнооперированных (SO) помета, которые находились под наблюдением до достижения возраста 3 месяцев; iv) 3 свиньи, отлученные от груди в возрасте 4 недель и находившиеся под наблюдением до 3 месяцев, были использованы для тестирования внутривенной инфузии амилазы поджелудочной железы. Все свиньи (шведский Landrace x Yorkshire x Hampshire) содержались индивидуально в отдельных загонах (1,0 х 1,5 м), оснащенных дозатором воды, опилками для постельных принадлежностей и лампой для обогрева. У ручек были окна, чтобы позволить социальное взаимодействие между соседними свиньями. Все экспериментальные процедуры были одобрены Мальмё-Лундом, Местным комитетом по этике для экспериментов на животных (номера разрешений: M170-14, M181-15). Все усилия были направлены на то, чтобы свести к минимуму страдания животных.

Отлученных от груди свиней кормили стандартным кормом на основе злаков («Моравский», Журавия, Польша или Växtill 320, Лантманнен, Швеция), что соответствует 4% их массы тела в день, половину рациона давали утром, между 08:00 –09: 00, а вторая половина дня - с 16:00 до 16:30. Свиньи имели свободный доступ к воде на время экспериментов.

Операция DJB была выполнена с созданием билиопанкреатической конечности (около 100 см длиной, обойденной от пищи), алиментарной конечности (около 100 см длиной) и оставшейся общей конечности. Ложные оперившие однопометники подвергались хирургическим манипуляциям без кишечных перестроек, как описано ранее [ 19 ].

Еще трех здоровых молодых неоперированных свиней использовали для оценки влияния внутривенной инфузии амилазы на результаты внутривенного теста на толерантность к глюкозе (Iv.GTT). Свиную панкреатическую альфа-амилазу (Lee Biosolutions, Inc., Мэриленд, США), 5000 ед. На свинью в стерильном 0,9% NaCl, вводили дважды через катетер для яремной вены, за 1 час и затем за 1 минуту до выполнения Iv.GTT. Для Iv.GTT глюкозу вводили в виде 40% раствора (1 г глюкозы / кг массы тела) через катетер яремной вены , который сразу после этого промывали 8 мл 0,9% стерильного солевого раствора. Каждой свинье дважды вводили Iv.GTT с внутривенной инфузией амилазы и без нее (отрицательный контроль), следуя схеме латинского квадрата.

В конце исследования всех свиней умерщвляли путем внутривенной инъекции передозировки пентобарбитала натрия (Allfatal Vet. Omnidea, Стокгольм, Швеция, 100 мг / кг).

Образцы крови, взятые у недоношенных и доношенных свиней, были взяты из пупочной вены примерно через 1 час после кесарева сечения или естественного рождения. Во всех других случаях кровь брали из постоянного катетера яремной вены, вставленного, как описано ранее, минимум за 1 неделю до сбора исследуемой пробы [ 19 ]. Образцы крови собирали в стеклянные пробирки B3 Vacutainer® Aprotinine K3EDTA (BD Diagnostics, Нью-Джерси, США). Концентрации глюкозы в крови измеряли непосредственно после забора крови с использованием глюкометра и тест-полосок (Accu-Chek® Aviva, Roche Diagnostics, Германия). Образцы крови сразу же помещали на лед, а затем центрифугировали при 3000 g в течение 15 минут при 4 ° C, и плазму отделяли и хранили при -20 ° C до дальнейшего анализа.

Концентрации плазменного инсулина и С-пептида измеряли с использованием наборов ELISA для свиного инсулина и С-пептида свиньи (Mercodia, Упсала, Швеция) в соответствии с инструкциями производителя. Амилолитическую активность в плазме анализировали с использованием этилиден-pNP-G7 (4,6-этилиден-п-нитрофенил-альфа, D-мальтогептаозида) в качестве субстрата в соответствии с инструкциями производителя (Infinity Amylase Liquid Stable Reagent; Thermo Fisher Scientific, Middletown, Вирджиния, США), с модификациями для считывателя микротитровальных планшетов.

Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM). Общая площадь под кривой (AUC) была рассчитана для уровней глюкозы, инсулина и С-пептида в крови после нагрузки с использованием правила трапеции. Все статистические анализы были выполнены с использованием среды программирования R (v. 3.0.1). Уровни инсулина, С-пептида и амилазы сравнивали с использованием парного (при необходимости) t-теста в разное время. Мы использовали поправку Бонферонни с α = 0,05, чтобы скорректировать множественное тестирование там, где это необходимо. Во всех статистических анализах p ≤ 0,05 считалось значимым, а p ≤ 0,1 считалось тенденцией.

Результаты

Активность амилазы в плазме составляла 539 ± 17 ед / л для недоношенных и 642 ± 94 ед / л для доношенных новорожденных поросят без вскармливания, тогда как уровни инсулина в плазме были ниже определяемого предела в обеих группах новорожденных ( Таблица 1 ). Уровни глюкозы в крови в первые часы после родов у недоношенных поросят составляли 3,0 ± 0,2 ммоль / л и 2,8 ± 0,4 ммоль / л у доношенных поросят на стадии препрандиации. У здоровых отнятых 3-месячных свиней активность амилазы в плазме крови была значительно ниже (на 50%) по сравнению с таковой у новорожденных доношенных поросят (р = 0,03, Таблица 1 ). Базовый уровень препрандиального уровня инсулина у взрослых свиней находился в определяемом диапазоне 3,3 пмоль / л. Таблица 1 ).

Операция на двенадцатиперстной кишке и тощей кишке не оказала значительного влияния на активность амилазы плазмы у молодых домашних свиней через 2 недели после операции ( Рис 1А ). Тем не менее, наблюдалось двукратное значительное увеличение активности амилазы в крови по сравнению с ложнооперированными однопометниками через 4 недели после операции DJB (р = 0,02, Рис 1А ). Через шесть недель после операции DJB исходная активность амилазы имела тенденцию к увеличению (p = 0,07) по сравнению с уровнем, наблюдаемым через 2 недели после операции у свиней DJB, в то время как у ложнопроходящих однопометников она не изменилась. Не было никаких существенных различий в концентрации глюкозы в крови натощак и концентрации инсулина натощак у свиней DJB, по сравнению с тем, что наблюдалось у ложнооперированных свиней ( Фиг 1В и 1С ).

Рисунок 1.

AC. Плазменная активность амилазы (A), концентрация глюкозы в крови (B) и концентрации инсулина в плазме крови у свиней, перенесших операцию на двенадцатиперстной кишке и тощей кишке (DJB), по сравнению с ложнооперированными однопометниками. Данные показаны как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 3). Коррекция Бонферонни с α = 0,05 была использована для корректировки данных для множественного тестирования. * p ≤ 0,05 значимая разница между ложнооперированными и DJB свиньями.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0198672.g001

Внутривенное вливание активной панкреатической амилазы свиньям, которые голодали в течение ночи, значительно повышало уровень активности амилазы в крови. Уровни амилазы в крови были примерно в 6 раз выше через 5 минут после инфузий амилазы в течение Iv.GTT, по сравнению с базовыми уровнями и по сравнению с уровнем, наблюдаемым в соответствующий момент времени без инфузии экзогенной амилазы ( Рис 2А ). Через два часа после нагрузки амилазой-глюкозой уровни амилазы в плазме все еще были на уровне 60% от уровня, измеренного через 5 минут после нагрузки. Однако увеличение активности амилазы в крови до внутривенного введения глюкозы не влияло на кривую глюкозы ( Рис 2б ). В то же время инфузия амилазы значительно снижала инсулиновый ответ через 15 минут (р = 0,04) после инфузии по сравнению с контрольным инсулиновым ответом, наблюдаемым без инфузии амилазы ( Рис 2с ). Общая площадь под кривой (AUC) для инсулинового ответа была значительно (р = 0,05) ниже после внутривенного введения амилазы. Внутривенная инфузия амилазы также привела к снижению уровня С-пептида через 5 минут (р = 0,01) после инфузии амилазы во время Iv.GTT по сравнению с уровнем, полученным без введения амилазы ( Фиг 2D ).

Рис 2. AD. Параметры плазмы у здоровых неоперированных растущих свиней.

(A) Амилазная активность, (B) глюкоза в крови, (C) плазменный инсулин и (D) концентрации C-пептида во время внутривенного теста на толерантность к глюкозе (Iv.GTT) либо отдельно, либо вместе с внутривенной инфузией амилазы поджелудочной железы (Amylase + Iv.GTT). Данные, представленные в виде среднего значения ± sem (n = 3), со значениями площади под кривой (AUC), показанными в скобках, t указывают на тенденцию с p ≤ 0,1. Данные не были исправлены для многократного тестирования.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0198672.g002

Наборы данных, сгенерированные и проанализированные в ходе текущего исследования, доступны по адресу https://figshare.com/s/2507c43abc95d4b82791

обсуждение

Наши наблюдения открывают новую перспективу для присутствия амилазы в кровообращении и ее обратной связи с инсулином во время созревания. Амилаза крови может иметь некоторые сигнальные эффекты внутри поджелудочной железы, которые регулируют эндокринную функцию поджелудочной железы. Специфическое взаимодействие между инсулином и амилазой поджелудочной железы ранее было продемонстрировано на крысиной модели, где стимулируемый глюкозой ответ инсулина был связан с увеличением амилазного компонента экзокринных гранул зимогена поджелудочной железы, в то время как у химотрипсиногена и липазы было снижено [ 10 ]. Результаты текущего исследования и результаты нашего предыдущего исследования [ 16 ] предполагают, что амилаза крови может снижать необходимый инсулиновый ответ, косвенно участвуя в усвоении глюкозы. С другой стороны, на ранних этапах жизни амилаза может принимать участие в утилизации глюкозы независимо от инсулина. Хорошо известно, что новорожденные свиньи используются в качестве модели для изучения желудочно-кишечной системы недоношенных детей [ 22 ]. У рожденных в природе свиней есть незрелый желудочно-кишечный тракт, который соответствует тракту недоношенных детей из-за его позднего созревания, которое происходит только во время последней стадии беременности. Таким образом, развитие желудочно-кишечного тракта у новорожденных поросят продолжается после рождения, и его функциональные возможности могут быть не такими, как у зрелых животных. В предыдущем исследовании, проведенном в нашей лаборатории (Pierzynowski et al., 1993), мы сообщали о неспособности повышать уровень инсулина в плазме у предварительно отлученных свиней, несмотря на повышение уровня глюкозы в крови, что свидетельствует о незрелом стимулированном глюкозой стимулировании инсулиновой реакции у молодых поросят [ 23 ]. Основываясь на наших предыдущих данных, мы предполагаем, что амилаза может регулировать незрелые кишечные энтероциты, которые способны поглощать и метаболизировать глюкозу. Альтернативно, роль амилазы в усвоении глюкозы может быть специфической характеристикой незрелой эндокринной поджелудочной железы.

Повышенные уровни амилазы в плазме, наблюдаемые у новорожденных поросят, также наблюдались у детей грудного возраста [ 5 ]. Принимая во внимание отсутствие специфических субстратов для ферментативного амилолитического действия, возможно, что уровни амилазы в крови в некоторой степени ответственны за регуляцию усвоения углеводов в этом возрасте. Отношение плазменного инсулина к плазменной активности амилазы может быть важной мерой, которую часто упускают из виду.

Повышенные уровни амилазы в крови, наблюдаемые после шунтирования двенадцатиперстной кишки, также могут быть связаны с обычно сообщаемым улучшением чувствительности к инсулину после бариатрической операции. Высокие уровни амилазы в крови часто связаны с увеличением выработки амилазы поджелудочной железой и ее последующей секрецией в кровоток. Ранее Reid et al. (1933) сообщили об увеличении активности амилазы крови у пациентов с диабетом, получающих диетическое, а не инсулиновое лечение [ 1 ]. Этот вывод подтверждает наши результаты, свидетельствуя об отрицательной корреляции между уровнями инсулина в крови и уровнями амилазы в крови. Уровень амилазы в крови постепенно увеличивался в нашей модели свиней DJB после операции ( Рис 1А ). Операция DJB создает физиологическую пищеварительную неэффективность, которая посредством естественных механизмов обратной связи сохраняется в пищеварительной и общих конечностях, стимулируя экзокринную функцию поджелудочной железы, что может привести к повышению активности амилазы плазмы. Стоит отметить, что мы предполагаем возможные регуляторные эффекты амилазы крови только на постпрандиальную гипергликемию и реакцию на инсулин, а не на базальные уровни глюкозы и инсулина в плазме. Для поддержания гомеостаза очень важно, чтобы базальные уровни оставались постоянными, и, таким образом, необходима какая-то регуляция, чтобы обеспечить успешное равновесие и быстрое возвращение к эвгликемии.

Результаты, наблюдаемые после внутривенного вливания амилазы, показывают, что амилаза поджелудочной железы, в частности, способна регулировать стимулированный глюкозой ответ инсулина. Важность амилазы в кровообращении очевидна, и в случае экзокринной недостаточности поджелудочной железы организм может попытаться нормализовать уровень амилазы в крови, используя другие источники амилазы. Это может объяснить ненадежные и неожиданно высокие уровни сывороточной / плазменной амилазы, о которых сообщалось во время экзокринной недостаточности поджелудочной железы [ 16 ].

В заключение, наши результаты предполагают, что отток амилазы из поджелудочной железы в интерстициальную кровь участвует в регуляции препрандиальной и постпрандиальной стимулированной глюкозой инсулиновой реакции. Результаты настоящего исследования показывают обратную зависимость между амилазой крови и уровнем инсулина в крови, что свидетельствует о важной роли амилазы в крови в усвоении глюкозы с пищей у растущих свиней.

Обратная зависимость между амилазой крови и уровнем инсулина у свиней во время развития, бариатрической хирургии и внутривенной инфузии амилазы

Вступление

материалы и методы

Результаты

обсуждение

Рекомендации