- Аннотация Для оценки различий в общих показателях здоровья и питательности морского леща ( Sparus...
- 2. Результаты и обсуждение
- 2.1. Плотский состав и активность кишечных пищеварительных ферментов
- Таблица 1
- Таблица 2
- 2.2. 13 C-ЯМР-спектры
- Рисунок 1
- Таблица 3
- фигура 2
- Рисунок 3
- 3. Экспериментальная часть
- 3.2. Измерения ЯМР
- 4. Выводы
Аннотация
Для оценки различий в общих показателях здоровья и питательности морского леща ( Sparus aurata ) были изучены эффекты полуинтенсивных наземных резервуаров и систем интенсивного разведения морских клеток и результаты по сравнению с отловленной дикой рыбой. Физиологическое состояние определяли путем измерения активности трех различных кишечных пищеварительных ферментов: щелочной фосфатазы (ALP), лейцин-аминопептидазы (LAP) и мальтазы; и активность печеночной ALP. Кроме того, было оценено содержание в печени белка, холестерина и липидов. 13C-ЯМР-анализ для качественной и количественной характеристики липидной фракции, извлеченной из мышц рыб, для полуинтенсивных и наземных резервуаров с интенсивными системами. Состав липидной фракции показал небольшие, но существенные различия в соотношении мононенасыщенных / насыщенных жирных кислот, при этом полуинтенсивный характеризуется более высоким содержанием мононенасыщенных и более низких насыщенных жирных кислот по сравнению с системой интенсивного разведения в наземных резервуарах.
Ключевые слова: дорада морского леща ( Sparus aurata ), ПНЖК, системы выращивания, пищевая аутентичность, физиологическое состояние питания, 13C ЯМР-профилирование.
1. Введение
Морской лещ Gilthead является одним из наиболее важных видов рыб, выращиваемых в Средиземноморском регионе, и его добыча все еще быстро расширяется [ 1 ]. Несмотря на то, что производство этих видов достигло высокого уровня качества и эффективности, знания о его потребностях в питании и процессах пищеварения очень скудны по сравнению с другими видами рыб [ 2 ]. В последние годы в нашей стране наблюдается рост спроса на морепродукты. Таким образом, как усилия по рыболовству (с последующим истощением рыбных ресурсов и развитием аквакультуры), так и импорт рыбы из других стран стали объектом мониторинга и исследования. По сравнению с мясом потребление морепродуктов ниже, несмотря на его питательные свойства [ 1 ]. Прежде всего, жирные кислоты, содержащиеся в рыбе, в частности эйкозапентаеновая кислота (20: 5 н- 3 или EPA), имеют важные функции для здоровья организма и отличаются от функций говядины и свинины, причем последняя богата холестерином. Напротив, жирные кислоты морепродуктов обладают способностью снижать уровень холестерина в крови и поэтому очень полезны для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний [ 2 ].
В частности, жирные кислоты из морепродуктов имеют решающее значение в рационе человека, потому что они являются одним из наиболее широко доступных природных источников эйкозапентаеновой (EPA) и докозагексаеновой (22: 6 n -3 или DHA) кислот. Пищевое потребление n- 3 жирных кислот имеет важное значение для роста и, в частности, для здоровья митохондриальных и клеточных мембран. Действительно, n- 3 жирные кислоты участвуют в синтезе гемоглобина, механизмах свертывания, предотвращении ломкости капилляров и других процессах, таких как размножение. Некоторые заболевания молочной железы и нарушения менструального цикла возникают в результате чрезмерного поглощения насыщенных жирных кислот и изменения отношения n -3 / n -6. Кроме того, n- 3 обеспечивает лучшую переносимость углеводов у диабетиков и является предшественниками простагландинов.
Было предпринято несколько попыток определить состав жирных кислот в различных типах природных жиров, таких как рыбные липиды [ 3 ], молочный жир [ 4 ], животный жир [ 5 ] и пищевые масла, в частности оливковое масло [ 6 , 7 ]. Анализ химических параметров проводился с использованием традиционных методов [ 8 , 9 ] в сочетании с другими аналитическими методами [ 10 ]. Среди них было обнаружено, что 1Н-, 13С- и 31Р-ядерный магнитный резонанс (ЯМР) с высоким разрешением является ценным инструментом для анализа липидов (включая липиды рыб). В дополнение к составу жирных кислот и классам липидов, 13C-ЯМР, в частности, дает информацию о региоспецифическом распределении жирных кислот по триацилглицеринам (TAG) [ 11 , 12 ] и фосфолипиды (13C- и 31P-ЯМР) [ 13 , 14 , 15 ]. Знание структуры TAG также становится все более важным, поскольку стереоспецифическая структура влияет на метаболизм липидов [ 16 , 17 ] и биодоступность жирных кислот.
Хотя ткани рыб варьируются в зависимости от таких факторов, как время года, возраст, диета и факторы окружающей среды, между видами существуют значительные генетические различия. Различные химические сдвиги ацильных цепей в положениях sn-1,3 и sn-2 позволяют проводить количественный анализ распределения жирных кислот в TAG с помощью 13 C-ЯМР. Карбонильная область (172–174 м.д.), олефиновые сигналы (126–134 м.д.), глицериновая область (60–74 м.д.) и алифатическая область (19–35 м.д.) спектров 13C-ЯМР были использованы для того, чтобы качественно и количественно оценить состав липидной фракции морского леща дрозда ( Sparus aurata ), выращенного в различных системах земледелия [ 7 , 11 , 12 , 18 , 19 ]. По данным итальянской ассоциации рыбоводов (Associazione Piscicoltori Italiani API), наиболее важная доля коммерчески доступного морского леща на итальянском рынке выращивается методом интенсивного выращивания рыбы (как в наземных аквариумах, так и в морских клетках). http://www.api-online.it ). В настоящей работе были исследованы три различных метода выращивания рыбы: полуинтенсивный, интенсивный наземный резервуар и интенсивный морской сад, первый из которых открыл путь к интересным перспективам контроля качества рыбного продукта. В дополнение к генетическим факторам, различные органолептические характеристики рыб (цвет, вкус) могут влиять на тип и способ кормления, плотность популяции в аквариумах или клетках, активность в плавании и другие факторы окружающей среды (температура, соленость, pH, оксигенация и т . Д. ). и (в пределах определенного диапазона) химический состав, в частности, липидного компонента.
Чтобы оценить возможные различия в питательной ценности, было изучено влияние трех систем выращивания на несколько параметров желудочно-кишечной функции, описывающих общее состояние здоровья образцов, и проведено сравнение с диким типом (использованным в качестве контроля). Общее сходство физиологического состояния выращенных рыб с таковым у дикого морского леща позволило нам сосредоточить последующие исследования на оценке качественного и количественного состава липидной фракции, извлеченной из мышц рыбы. В частности, насыщенные и незаменимые полиненасыщенные жирные кислоты ( n- 3 и n -6) образцов коммерческого разведения дорады морского леща ( Sparus aurata ), полученные с использованием различных методов выращивания рыб: полуинтенсивные (бассейн Акватина, Фриголе-Лечче, Апулия, Италия) и интенсивный в наземных резервуарах (система аквакультуры Maribrin srl, 8 км к югу от Бриндизи, Апулия, Италия) были дополнительно изучены методом 13C-ЯМР.
2. Результаты и обсуждение
Пищевое физиологическое состояние (оцениваемое путем измерения активности трех различных кишечных пищеварительных ферментов и состава мякоти) и характеристика ЯМР липидных фракций будут обсуждаться отдельно.
2.1. Плотский состав и активность кишечных пищеварительных ферментов
Результаты, касающиеся содержания белка в печени, показали, что в ходе исследования изменилось только количество белка, измеренное у полуинтенсивных разводимых рыб, причем оно было выше (803,17 ± 38,63 мг белка / г сухой ткани, данные не показаны) в начале испытания и ниже. в конце (377,73 ± 4,15 мг белка / г сухой ткани), в то время как он оставался неизменным в наземных аквариумах для интенсивных и морских животных. Содержание печеночного белка в рыбе, выращенной в наземных аквариумах, было самым высоким в конце испытания, тогда как содержание липидов было ниже по сравнению с другими выращенными группами рыб. Кроме того, для оценки общего состояния здоровья выращенной рыбы для сравнения приведены данные по дикому морскому лещу, отловленному в конце испытательного периода. Содержание холестерина оказалось одинаковым при всех условиях выращивания рыбы, но ниже по сравнению с контролем дикого типа (,).
Рыбы, выращенные в полуинтенсивных и в интенсивных условиях морских клеток, показали значительно более высокую активность кишечной щелочной фосфатазы (ALP) во время испытания, но никаких существенных различий в ферментативной активности ALP не наблюдалось в конце испытания для всех исследованных групп. по отношению к контролю. Кроме того, в случае мальтазной активности полуинтенсивная и интенсивно выращиваемая в морской клетке рыба проявляла более высокую активность по отношению к рыбе, выращенной в наземных интенсивных условиях, при этом разница в активности становилась незначительной в конце испытания. Что касается активности лейцин-аминопептидазы (LAP), в начале исследования не было выявлено существенных различий между группами. Тем не менее, в конце этого времени рыбы в наземных аквариумах с интенсивным выращиванием показали более низкую активность, в то время как рыба с полуинтенсивным и интенсивным выращиванием в морских клетках не показала существенных различий между ними и контролем. Активность ALP в печени не показала значительных различий между группами, за исключением исходного значения, измеренного у полуинтенсивно выращиваемой рыбы. В целом, ферментативная активность, измеренная у выращенной рыбы в конце испытания, не показала существенных отличий от таковой у дикого морского леща () в конце испытания. Из-за сходства физиологического состояния рыб, выращенных в режиме на суше и в морских клетках, последующие исследования были сосредоточены на оценке качественного и количественного состава липидной фракции, извлеченной из мышц рыб только двух систем выращивания: полу- интенсивный и наземный интенсивный, поскольку последняя является наиболее распространенной коммерческой системой интенсивного разведения (ISMEA-Istituto di Servizi per il Mercato Agricolo Alimentare, http://www.ismea.it ).
Таблица 1
Содержание печеночного белка, липидов и холестерина для трех разных систем разведения и дикие образцы (контроль) в конце испытания. Каждое значение представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение 3-х повторностей.
(мг / г сухой ткани) Полуинтенсивный Наземные интенсивные морские клетки Дикий морской лещ Белок 377,73 ± 4,15 585,88 ± 32,82 488,57 ± 15,89 486,45 ± 15,31 Липиды 626,00 ± 62,39 358,92 ± 30,05 414,68 ± 56,52 506,27 ± 75,44 Холестерин 6,31 ± 0,76 9,1 0,11 6,05 ± 0,01 11,07 ± 0,57
Таблица 2
Значимость различий (p-значений) в содержании печеночного белка, липидов и холестерина для трех различных систем разведения и диких образцов (контроль) в конце испытания на основе t-теста для 3 независимых образцов. Однородность дисперсий всегда выполняется при значении р 0,05.
Полуинтенсивный по сравнению с наземным интенсивным Полуинтенсивный по отношению к морским клеткам Полуинтенсивный против дикого морского леща Земной интенсивный по отношению к морским клеткам Земной интенсивный против дикого морского леща Морские клетки против дикого морского леща Белок <0,001 0,004 <0,001 0,010 0,009 0,876 Липиды 0,003 0,006 0,069 0,206 0,035 0,168 Холестерин 0,003 0,589 <0,001 <0,001 0,004 <0,001
2.2. 13 C-ЯМР-спектры
Спектры 13C-ЯМР различных выращенных образцов Sparus aurata (наземные резервуары, интенсивные и полуинтенсивные в конце испытания) обрабатывали, применяя коррекцию базовой линии (используя полиномиальную функцию). Затем, чтобы облегчить интеграцию пиков, возникающих от n- 3 жирных кислот в положениях sn-1,3 и sn-2, деконволюцию проводили в карбонильной и метильной областях спектров. Наконец, интеграция сигналов выбрана по их значимости на основе литературных данных [ 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 ], было выполнено.
Чтобы рассчитать состав жирных кислот для каждого образца, средневзвешенное значение сигналов при 62,01 м.д. и 68,83 м.д., относящихся соответственно к α- и β-углеродам глицериновой группы, было выбрано для нормализации в качестве внутреннего стандарта [ 26 ]. Типичный 13 С-ЯМР спектр липидной фракции морского леща-дрозда показан на фиг. Основные различия между образцами из двух разных систем земледелия отражаются на интенсивности сигналов в спектрах 13C-ЯМР. Расширение области карбонильных атомов углерода (атомов C1) (173,5–172,0 млн -1) показано на рис. Резонансы назначались в соответствии с предыдущими исследованиями липидов рыб [ 9 ]. В целом, химические сдвиги карбонильных атомов углерода жирных кислот в триацилглицеролах зависят от региоспецифического положения (является ли жирная кислота цепью sn-1,3 или sn-2), а также от положения и числа двойных связей в ненасыщенных жирные кислоты [ 27 , 28 ].
Рисунок 1
Вверху слева кишечная активность щелочной фосфатазы; нижняя левая кишечная активность лейцин-аминопептидазы; вверху справа - кишечная мальтазная активность; нижняя правая печеночная фосфатазная активность. Данные по диким образцам, использованным в качестве контроля, приведены только за последний месяц испытательного периода. Каждое значение представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение 3-х повторностей. Пары значительно отличающихся средних значений (на основе t-критерия для независимых выборок, p-значения <0,05) помечены одинаковым символом. Однородность дисперсий всегда выполняется при значении р 0,05.
Интенсивности резонансов ацильных цепей в триглицеридах описывают профиль жирных кислот различных образцов. Химические сдвиги карбонильных атомов углерода жирных кислот связаны с различиями в специфическом этерифицированном положении на глицерине: те, которые на высоких частотах (защитные сигналы) связаны с жирными кислотами, этерифицированными в 1,3 положениях глицерина, тогда как соответствующие жирные кислоты в положении 2 защищены 0,40 ч / млн по отношению к sn-1,3. Эта разница в химическом сдвиге наблюдается всегда, независимо от исследуемой жирной кислоты.
В карбонильной области спектров 13C-ЯМР () сигналы насыщенных жирных кислот (стеариновая кислота, пальмитиновая кислота) и олеиновой кислоты обнаруживаются в одном и том же порядке с высоких частот (положение sn-1,3 в глицериновой части) ) к низким частотам (sn-2 в глицериновой части), в то время как пики линолевой и линоленовой жирных кислот перекрываются (в области используемых инструментов), чтобы дать один сигнал (не показан). В частности, полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) ряда n- 3 (докозагексаеновая кислота, ДГК и эйкозапентаеновая кислота, ЭПК) более защищены от других жирных кислот [ 29 ].
Назначения были подтверждены резонансами, присутствующими в области виниловых углеродов, где, несмотря на большее перекрытие, можно различить сигналы, связанные с n- 3 ПНЖК, от полиненасыщенных жирных кислот, не принадлежащих к серии n- 3 ( n - 6 PUFA).
Следует отметить, что в исследованных образцах пальмитиновая (16: 0) и стеариновая (18: 0) жирные кислоты являются наиболее распространенными среди насыщенных ЖК, в то время как олеиновая кислота (18: 1 n -9) преобладает среди мононенасыщенных жирных кислот. кислоты. С другой стороны, n- 3 жирные кислоты, в частности DHA и EPA, являются основными составляющими полиненасыщенной фракции. Во всех образцах, независимо от рассматриваемых систем земледелия, соотношение ЭПК / ДГК является приблизительно постоянным и составляет около 1: 2 для всех экстрактов. Как уже сообщалось в других образцах рыб, в данном случае полиненасыщенные жирные кислоты предпочтительно этерифицированы в положении sn-2 глицерина, тогда как насыщенные и мононенасыщенные жирные кислоты связаны в положении sn-1,3.
Таблица 3
Процентное и стандартное отклонения жирных кислот в липидных фракциях (интенсивные и полуинтенсивные образцы), рассчитанные методом 13 C-ЯМР-спектроскопии. (SFA: насыщенные жирные кислоты; PUFA: полиненасыщенные жирные кислоты; n-3 HUFA: высоконенасыщенные жирные кислоты). Каждое значение является средним из трех повторностей. Значительные различия в средних значениях обозначены как «*» (р-значение 0,004) или «#» (р-значение 0,02) на основании t-критерия для независимых выборок. Однородность дисперсий всегда выполняется при значении р 0,05.
Система выращивания Интенсивный Полуинтенсивный 22: 6 n -3 7,8 ± 2,5 6,1 ± 1,7 20: 5 n -3 4,1 ± 1,6 3,6 ± 0,4 18: 3 n -3 8,0 ± 2,7 9,7 ± 3,9 18: 1 n -9 24,1 ± 0,6 * 30,9 ± 1,9 * SFA 39,5 ± 0,7 # 35,5 ± 1,7 # PUFA 17,0 ± 2,3 15,6 ± 4,2 n -3 HUFA 19,9 ± 1,4 19,7 ± 3,0 отношение n -3 / n -6 1,2 1,3 соотношение 18: 1 n -9 / SFA 1.6 1.2
Процентный состав липидного компонента был проанализирован для различных систем земледелия. Результаты, полученные для образцов (из данных 13C-ЯМР), показаны в. Образцы обоих типов показывают примерно одинаковое соотношение n- 3 и n- 6 жирных кислот, с несколько более высоким соотношением в образцах S. Aurata, относящихся к полуинтенсивной системе земледелия. Никаких существенных различий специально не наблюдалось для DHA, EPA и 18: 3 жирных кислот для двух исследованных систем выращивания. Также содержание PUFA не показывает существенных различий. С другой стороны, небольшие, но существенные различия были очевидны в отношении мононенасыщенных / насыщенных жирных кислот. Образцы системы интенсивного разведения в наземных резервуарах показали более высокое содержание насыщенных жирных кислот и более низкое содержание мононенасыщенных жирных кислот по сравнению с полуинтенсивными. По-видимому, это единственное существенное различие с точки зрения питательной ценности, обнаруженное для рыб, выращенных с использованием двух исследованных коммерческих систем: полуинтенсивных и наземных аквариумов. Для объяснения этих данных или выявления дополнительных различий и / или корреляций потребуется дальнейший анализ образцов, возможно взятых в течение всего испытательного периода. 30 ].
фигура 2
Спектры 13C-ЯМР в CDCl3 липидной фракции Sparus aurata .
Рисунок 3
Расширения 13 С-ЯМР спектров липидных фракций Sparus aurata относительно карбонильной области углерода. 1,3-поз. и 2-поз. относятся к положению этерифицированных жирных кислот на глицерине (вверху: интенсивно; снизу: полуинтенсивно; SFA: насыщенные жирные кислоты).
3. Экспериментальная часть
3.1. Подготовка образцов и анализ ферментативной активности
Испытание проводилось в промежутке времени между маем и ноябрем в регионе Апулия (Италия), и были проведены три различных отбора проб. Коммерческий экструдированный корм (Biomar-Treviso, Италия) использовали для всех рыб со скоростью кормления 1-2% массы тела рыбы в день, 7 дней в неделю. Конечная плотность разведения рыбы составляла 4, 15 и 25 кг / м3 для полуинтенсивных, морских клеток и наземной интенсивной системы, соответственно. Ферментативные активности измеряли в кишечнике и гомогенате печени, согласно Storelli et al . [ 31 ], используя спектрофотометрические методы.
3.2. Измерения ЯМР
Липидные фракции, полученные из мышечной ткани Sparus aurata , были извлечены с использованием метода Bligh & Dyer [ 32 ] и проанализированы с помощью 1D и 2D ЯМР спектроскопии. Образцы ЯМР готовили путем сушки экстракта в потоке азота и затем растворяли в 1 мл CDCl3. Спектры ЯМР были получены при 301,15 К на Bruker Avance DPX 400 МГц. CDCl3 использовали в качестве растворителя, и химический сдвиг указывали на TMS по остаточным пикам протонного растворителя в качестве внутренних эталонов (δΗ = 7,24 ч / млн; δC = 77,0 ч / млн).
Спектры 1H-ЯМР были получены при частоте 400,13 МГц, импульсная программа zg, 32K точек данных, ширина спектра 11990 Гц, 128 сканирований с задержкой повторения 3 с. Спектры ЯМР 13C {1H} были получены в соответствии со следующими параметрами: импульсная программа zgig30, ширина спектра 99911 Гц, точки данных 256K, задержка повторения 2,5 с, 4 фиктивных сканирования, 6000 сканирований. Спектральная обработка, интеграция и деконволюция выполнялись с использованием программного обеспечения Topspin 1.2 (Bruker Biospin). Резонансы жирных кислот были назначены на основании литературных данных [ 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 ].
4. Выводы
Полученные результаты показывают, что морской лещ выращивается в особых условиях, как в полуинтенсивных, так и в интенсивных (наземных аквариумах и морских клетках) системах, присутствующих в конце периода размножения, физиологическое состояние питания, сопоставимое с таковым у дикого морского леща. захвачен в прибрежной зоне (контроль). Измеренная активность кишечных ферментов была одинаковой во всех образцах, независимо от источника (полуинтенсивные, интенсивные наземные резервуары, интенсивные морские клетки и дикий тип).
Для полуинтенсивных и наземных резервуаров с интенсивной системой состав липидной фракции, извлеченной из плоти рыб, был получен с помощью 13 С-ЯМР и проанализирован профиль липидов. Не наблюдалось значительных различий в процентах содержания ПНЖК (DHA, EPA, 18: 3) для образцов, полученных из двух исследованных систем выращивания [ 33 , 34 , 35 ]. С другой стороны, небольшие, но существенные различия были обнаружены в отношении мононенасыщенных / насыщенных жирных кислот, при этом полуинтенсивный характер характеризуется более высоким содержанием мононенасыщенных и более низких насыщенных жирных кислот в отношении системы интенсивного разведения в наземных резервуарах. Поэтому представленные данные позволяют предположить, что в используемых экспериментальных условиях соотношение мононенасыщенных / насыщенных жирных кислот является наблюдаемым параметром, учитывающим различия в качестве питательных веществ в содержании липидов морского леща S. Aurata, повышенного в системах интенсивного и полуинтенсивного выращивания.